Cómo leer un cromatograma HPLC: retención, área y resolución

Leer los ejes e identificar la inyección

Un cromatograma HPLC suele representar la respuesta del detector frente al tiempo transcurrido, normalmente en minutos. Un detector ultravioleta puede expresar la respuesta en miliunidades de absorbancia (mAU) a una longitud de onda indicada. El área se integra en el tiempo; la tabla puede usar mAU·s u otra unidad de señal por tiempo. Relaciona el identificador de muestra y el número de inyección con el análisis pertinente. Blanco, referencia y muestra tienen finalidades distintas.

El tiempo de retención depende del método: columna, fases móviles y gradiente, temperatura, caudal y otras condiciones. Compara el pico con una referencia apropiada analizada con el mismo método o con un criterio de retención relativa establecido. La coincidencia aporta una prueba de asignación, pero otros componentes pueden eluir en la misma ventana.

EMA, Synthetic peptides guideline, §§ 2, 4.1, 4.3 and 4.4 · ICH Q2(R2), Validation of Analytical Procedures, corrected April 2025

Recalcular el porcentaje de área

En una inyección UV ficticia, las áreas incluidas son 930, 50 y 20 mAU·s. El pico principal representa 930 ÷ 1000 × 100 = 93,0 % del área. Si una regla documentada excluye la señal de 20 mAU·s, el denominador pasa a 980 y el porcentaje sube a 94,9 %. Ambos valores describen la misma señal con reglas diferentes. Comprueba si la exclusión corresponde al blanco, al disolvente, a un umbral de notificación o a otro motivo documentado.

La línea de base y los límites de integración influyen en las áreas. Solicita la tabla y el cromatograma con las marcas de integración, sobre todo si hay deriva o un hombro. La respuesta también puede variar entre componentes: si masas iguales producen 100 y 50 unidades de área, el componente con mayor respuesta aporta dos tercios del área, aunque las masas sean iguales.

EMA, Synthetic peptides guideline, §§ 2, 4.1, 4.3 and 4.4

Comprobar la separación entre picos vecinos

La resolución cromatográfica de IUPAC es la diferencia entre tiempos de retención dividida por la anchura media de los dos picos en la base. Para picos a 5,20 y 5,32 min, cada uno de 0,08 min de anchura en la base, Rₛ = 0,12 ÷ 0,08 = 1,50. Mantén la misma definición de anchura. Los métodos que usan anchuras a media altura emplean la fórmula correspondiente. La aceptación depende del requisito del método para ese par de picos.

Un pico simétrico puede ocultar coelución. Si importa una impureza solapada, busca pruebas mediante una mezcla de referencia, otra separación o una detección complementaria adecuada. La ausencia de un hombro por sí sola demuestra poco sobre la separación de una impureza concreta.

Conserva la señal completa, la tabla anotada, el método y su revisión, los ajustes del detector, la referencia y el resultado de aptitud del sistema. Anota las pruebas de asignación, el denominador usado y los pares sin resolver. Compara porcentajes entre análisis solo tras comprobar que las condiciones y las reglas son comparables.

IUPAC Gold Book, Peak resolution in chromatography · ICH Q2(R2), Validation of Analytical Procedures, corrected April 2025

Comparar dos señales del modelo

La referencia tiene centros a 3,00 y 4,60 min, con σ = 0,35 min para ambos picos. Las anchuras en la base se aproximan por 4σ = 1,40 min y Rₛ = 1,60 ÷ 1,40 = 1,143. Al situar los centros a 3,00 y 3,60 min, Rₛ = 0,429. Las alturas y anchuras no cambian.

Puedes reproducir estos ajustes en el explorador. Los componentes se conocen porque el ejemplo los genera; un detector real puede proporcionar únicamente la señal combinada.

Soluciones desarrolladas

IUPAC Gold Book, Peak resolution in chromatography