HPLC-Chromatogramme lesen: Retention, Peakfläche und Auflösung

Achsen lesen und Messlauf zuordnen

Ein HPLC-Chromatogramm zeigt meist die Detektorantwort über der verstrichenen Zeit, häufig in Minuten. Bei UV-Detektion kann die Antwort in Milliabsorptionseinheiten (mAU) bei einer angegebenen Wellenlänge stehen. Die zeitlich integrierte Peakfläche kann beispielsweise in mAU·s angegeben sein. Ordnen Sie Probenkennung und Injektionsnummer dem gewünschten Lauf zu. Blindwert, Referenz und Prüfprobe erfüllen unterschiedliche Aufgaben.

Die Retentionszeit hängt von der Methode ab: unter anderem von Säule, mobiler Phase und Gradient, Temperatur und Fluss. Vergleichen Sie mit einer geeigneten Referenz unter derselben Methode oder anhand eines festgelegten relativen Retentionskriteriums. Eine passende Retentionszeit stützt die Zuordnung; andere Stoffe können im selben Zeitfenster eluieren.

EMA, Synthetic peptides guideline, §§ 2, 4.1, 4.3 and 4.4 · ICH Q2(R2), Validation of Analytical Procedures, corrected April 2025

Den Flächenanteil nachrechnen

In einem fiktiven UV-Lauf betragen die einbezogenen Flächen 930, 50 und 20 mAU·s. Der Hauptpeak trägt 930 ÷ 1.000 × 100 = 93,0 % zur Gesamtfläche bei. Schließt eine dokumentierte Regel das 20-mAU·s-Signal aus, beträgt der Nenner 980 mAU·s und der Anteil steigt auf 94,9 %. Beide Werte beschreiben dieselbe Spur mit unterschiedlichen Integrationsregeln. Klären Sie, ob Blindwert- oder Lösungsmittelsignale, eine Berichtsgrenze oder andere Regeln den Ausschluss begründen.

Basislinie und Integrationsgrenzen beeinflussen die Flächen. Fordern Sie die Peaktabelle und die Spur mit Integrationsmarkierungen an, insbesondere bei Drift oder einer Schulter am Hauptpeak. Auch die Detektorantwort ist stoffabhängig: Erzeugen gleiche Massen 100 und 50 Flächeneinheiten, entfallen zwei Drittel der Fläche auf den stärker antwortenden Stoff, obwohl die Massen gleich sind.

EMA, Synthetic peptides guideline, §§ 2, 4.1, 4.3 and 4.4

Die Trennung benachbarter Peaks prüfen

Die chromatographische Auflösung nach IUPAC ist die Differenz der Retentionszeiten geteilt durch die mittlere Basisbreite. Für Peaks bei 5,20 und 5,32 min mit je 0,08 min Basisbreite gilt Rₛ = 0,12 ÷ 0,08 = 1,50. Verwenden Sie durchgehend dieselbe Breitendefinition. Für Halbwertsbreiten gilt eine andere zugehörige Formel. Ob eine Auflösung ausreicht, richtet sich nach der Anforderung der Methode an dieses Peakpaar.

Auch ein symmetrischer Peak kann koeluierten Stoff enthalten. Wenn eine überlappende Verunreinigung relevant ist, helfen eine Referenzmischung, eine andere Trennung oder eine geeignete zusätzliche Detektion. Eine fehlende Schulter allein ist kein belastbarer Trennungsnachweis.

Bewahren Sie vollständige Spur, annotierte Peaktabelle, Methode und Revision, Detektoreinstellungen, Referenz und Systemeignungsprüfung auf. Notieren Sie die Zuordnungsbelege, den Nenner der Flächenrechnung und ungelöste Peakpaare. Vergleichen Sie Prozentwerte erst, wenn Methode und Berichtsregeln vergleichbar sind.

IUPAC Gold Book, Peak resolution in chromatography · ICH Q2(R2), Validation of Analytical Procedures, corrected April 2025

Zwei Modellspuren vergleichen

Im Referenzmodell liegen die Zentren bei 3,00 und 4,60 min, bei σ = 0,35 min für beide Peaks. Die Basisbreiten sind näherungsweise 4σ = 1,40 min und Rₛ = 1,60 ÷ 1,40 = 1,143. Bei Zentren von 3,00 und 3,60 min ergibt sich Rₛ = 0,429. Höhen und Breiten bleiben dabei unverändert.

Im Peak-Explorer lassen sich dieselben Einstellungen reproduzieren. Die Komponenten sind bekannt, weil das Beispiel sie selbst erzeugt; ein tatsächlicher Detektor liefert unter Umständen nur das Summensignal.

Musterlösungen

IUPAC Gold Book, Peak resolution in chromatography