¿Qué se calibra realmente?
En la calibración externa, disoluciones de concentración conocida establecen la relación entre respuesta y concentración. La muestra se interpreta mediante esa relación. Preparación, inyección y comportamiento del detector deben ser suficientemente comparables entre patrones y muestras. La calibración externa puede ser adecuada cuando se controlan esas condiciones y se demuestra el rendimiento previsto.
En la calibración interna se añade un patrón distinguible a calibradores, controles y muestras. El cociente reduce variaciones que afectan proporcionalmente a ambas sustancias. Los métodos UV necesitan señales medibles por separado; LC–MS puede distinguir por masa algunos compuestos isotópicamente marcados que coeluyen. Es una elección analítica, no una regla de superioridad universal del patrón interno.
Agilent OpenLab: internal-standard calculation and response ratios · ICH M10, §3.1–3.2: reference standards, matrix effects and calibration (FDA)
Seguir el cálculo hasta la muestra original
Ejemplo sintético con concentración constante de patrón interno: R = Aₓ/Aᵢₛ y calibración R = 0,020 × c + 0,010, donde c es la concentración del analito en µg/mL en la disolución preparada para medir. Para R = 0,410, c = (0,410 − 0,010)/0,020 = 20,0 µg/mL. La pendiente tiene unidades mL/µg y el cociente de respuestas es adimensional.
Si la disolución original se diluyó diez veces para obtener esa disolución de medida, su concentración es 200 µg/mL, suponiendo que no haya otras conversiones. Esto aún no determina la cantidad en un sólido o vial: hacen falta pesada inicial, volumen de extracción y cálculo definido por el procedimiento. Si varía la concentración del patrón interno, utiliza el modelo calibrado de razón de cantidades en vez de suponer que es constante.
Cálculo sintético con nivel fijo de patrón interno
En pantallas estrechas, desplaza la tabla lateralmente. Con el teclado, enfoca la tabla y usa las flechas.
| Etapa | Valor | Significado |
|---|---|---|
| Cociente de respuestas medido | 0,410 | Área del analito dividida por área del patrón |
| Resultado de calibración | 20,0 µg/mL | Disolución preparada para medir |
| Corrección de dilución diez veces | 200 µg/mL | Disolución original bajo el supuesto indicado |
Qué errores corrige el cociente y cuáles no
Supongamos que una inyección menor reduce ambas áreas un 10 %. Su cociente no cambia. Si un interferente no resuelto aumenta solo el área del analito, el cociente queda sesgado. Si se pierde analito durante la extracción y el patrón se añade después, este nunca experimentó la pérdida. El momento de adición determina qué etapas puede monitorizar.
Revisa la respuesta bruta del patrón además del cociente. Un cociente aparentemente normal puede ocultar que ambas señales sean muy pequeñas; una respuesta del patrón anormalmente alta puede indicar un error de adición o una interferencia. La idoneidad incluye estabilidad, ausencia de contribuciones no deseadas en el canal y comportamiento en la matriz y el intervalo previstos.
Waters: Stable-Isotope-Labeled Internal Standards and Matrix Effects · Agilent OpenLab: internal-standard calculation and response ratios
Comprobar el método más allá de la recta
Un modelo de calibración necesita una relación de respuesta y un intervalo adecuados. Un coeficiente de correlación alto no demuestra por sí solo concentraciones correctas en todo el intervalo. Examina residuos y patrones recalculados y utiliza preparaciones de control independientes apropiadas. No impongas intercepto cero, ponderación o un intervalo más amplio solo para mejorar el aspecto de la gráfica.
Conserva identidad y concentración asignada del patrón inicial, registros de preparación, unidades, tratamiento del blanco, momento de adición del patrón interno y factores de dilución. Sigue cada conversión desde la señal hasta el resultado. Para una muestra fuera del intervalo puede ser apropiado diluir justificadamente y repetir; prolongar la recta dibujada no demuestra que sea válida la extrapolación.
Las recomendaciones de ICH M10 se refieren a muestras de estudios bioanalíticos; otros usos necesitan un diseño propio justificado. La calibración conecta señal y cantidad en condiciones definidas. La validación y las comprobaciones de cada secuencia evalúan con qué fiabilidad cumple esa función el procedimiento completo.