Was wird tatsächlich kalibriert?
Bei externer Kalibrierung bestimmen Lösungen bekannter Analytkonzentration den Zusammenhang zwischen Antwort und Konzentration. Anschließend wird die Probe mit diesem Zusammenhang ausgewertet. Vorbereitung, Injektion und Detektorverhalten müssen zwischen Standards und Proben ausreichend vergleichbar sein. Sind diese Bedingungen kontrolliert und die vorgesehene Leistung belegt, kann externe Kalibrierung angemessen sein.
Bei interner Kalibrierung wird ein unterscheidbarer Standard zu Kalibratoren, Kontrollen und Proben gegeben. Das Antwortverhältnis verringert Schwankungen, die beide Substanzen proportional beeinflussen. UV-Methoden benötigen separat messbare Signale; LC–MS kann koeluierende isotopenmarkierte Verbindungen teilweise über ihre Masse unterscheiden. Die Auswahl ist eine analytische Entscheidung, keine pauschale Regel zugunsten interner Kalibrierung.
Agilent OpenLab: internal-standard calculation and response ratios · ICH M10, §3.1–3.2: reference standards, matrix effects and calibration (FDA)
Eine Rechnung bis zur Ausgangsprobe verfolgen
Synthetisches Beispiel bei konstanter Konzentration des internen Standards: R = Aₓ/Aᵢₛ und die Kalibrierfunktion R = 0,020 × c + 0,010, wobei c die Analytkonzentration in µg/mL in der vorbereiteten Messlösung bezeichnet. Für R = 0,410 gilt c = (0,410 − 0,010)/0,020 = 20,0 µg/mL. Die Steigung hat somit die Einheit mL/µg; das Antwortverhältnis ist dimensionslos.
Wurde die Ausgangslösung zur Messlösung zehnfach verdünnt, beträgt ihre Konzentration 200 µg/mL, sofern nur diese weitere Umrechnung nötig ist. Das bestimmt noch keine Menge in einer Feststoffprobe oder einem Vial: Dafür braucht es Einwaage, Extraktionsvolumen und die festgelegte Verfahrensrechnung. Bei variierender Konzentration des internen Standards muss das kalibrierte Mengenverhältnismodell verwendet werden, statt stillschweigend Konstanz anzunehmen.
Synthetische Rechnung bei konstantem internen Standard
Auf schmalen Bildschirmen die Tabelle seitlich scrollen. Mit der Tastatur: Tabelle fokussieren und Pfeiltasten verwenden.
| Schritt | Wert | Bedeutung |
|---|---|---|
| Gemessenes Antwortverhältnis | 0,410 | Analytfläche geteilt durch Standardfläche |
| Kalibrierergebnis | 20,0 µg/mL | Vorbereitete Messlösung |
| Zehnfache Verdünnung zurückgerechnet | 200 µg/mL | Ausgangslösung unter der genannten Annahme |
Welche Fehler das Verhältnis ausgleichen kann
Verringert eine kleinere Injektion beide Flächen um 10 %, bleibt ihr Verhältnis gleich. Vergrößert dagegen ein ungetrennter Störstoff nur die Analytfläche, ist das Verhältnis verzerrt. Geht Analyt bei der Extraktion verloren und wird der Standard erst danach zugesetzt, hat dieser den Verlust nicht miterlebt. Der Zugabezeitpunkt bestimmt deshalb, welche Schritte der Standard überwachen kann.
Neben dem Verhältnis auch die rohe Standardantwort prüfen. Ein unauffälliges Verhältnis kann verbergen, dass beide Signale sehr klein geworden sind. Eine ungewöhnlich hohe Standardantwort kann auf einen Zugabefehler oder eine Interferenz hindeuten. Zur Eignung gehören Stabilität, fehlende unerwünschte Beiträge im Messkanal und das Verhalten in der vorgesehenen Matrix über den Arbeitsbereich.
Waters: Stable-Isotope-Labeled Internal Standards and Matrix Effects · Agilent OpenLab: internal-standard calculation and response ratios
Mehr prüfen als die angepasste Gerade
Ein Kalibriermodell benötigt einen passenden Antwortzusammenhang und Arbeitsbereich. Ein hoher Korrelationskoeffizient allein belegt keine richtigen Konzentrationen im ganzen Bereich. Residuenmuster und rückgerechnete Standards untersuchen und das Verfahren mit geeigneten unabhängigen Kontrollansätzen prüfen. Nullachsenabschnitt, Gewichtung oder Bereich nicht allein wählen, damit die Grafik besser aussieht.
Identität und zugewiesene Konzentration des Stammstandards, Herstellprotokolle, Einheiten, Blindwertbehandlung, Zugabezeitpunkt des internen Standards und Verdünnungsfaktoren dokumentieren. Ein Ergebnis vom Detektorsignal durch jede Umrechnung verfolgen. Für eine Probe außerhalb des Bereichs können begründete Verdünnung und erneute Analyse geeignet sein; eine verlängerte Gerade belegt keine zulässige Extrapolation.
Die Empfehlungen von ICH M10 betreffen bioanalytische Studienproben. Andere Verwendungszwecke benötigen ein eigenes begründetes Design. Kalibrierung verknüpft Signal und Menge unter benannten Bedingungen; Validierung und laufende Sequenzprüfungen untersuchen, wie zuverlässig das vollständige Verfahren diese Aufgabe erfüllt.